注】：本文比较专业，涉及专业名词等，适合生物，中药等专业的人阅读，如果特别对灵芝，灵芝孢子粉，灵芝孢子油方面感兴趣的朋友，只需要看我标出来的黑体字结论就可以。其余可忽略不看。

  陈若芸教授：中国医学科学院药物研究所研究院，长期从事灵芝，灵芝孢子粉成分研究

  引言：此为〈2015灵芝研发与应用学术研讨会〉上的演讲，陈若芸把重点摆在灵芝特有的“三萜化合物”和三萜酸含量的检测的新方法上，并根据19种赤芝常见的三萜化合物，以HPLC建立赤芝子实体的指纹图谱，提供产官学界作为较快地断定赤芝材料的品质好坏的工具。此外，不论是比较整体的化学成分或三萜类的种类与含量，都显示赤芝与紫芝应设立不同的质量控制指标，在药典上也应分属两种不同中药材；而三萜含量极低的孢子粉与孢子油，则应各别建立不同于子实体的质控指标。相对于药理作用和临床疗效，化学成分分析的研究成果受到的瞩目显然少很多，但后者却是支撑前者能否有效而稳定发挥的基石。灵芝里的化学成分众多，从事灵芝化学成分分析三十多年的陈若芸，把此次的演讲重点摆在灵芝特有的“三萜化合物”上。

  根据她和团队的研究发现，灵芝（赤芝）、松杉灵芝有较相似的三萜化合物，但紫芝和硬孔灵芝几乎不含这些成分，因此两组灵芝属应有不同的质控指标成分。再者，赤芝子实体必有三萜化合物，孢子粉和孢子油几乎都没有，因此不同生长阶段取得的灵芝材料，应分别建立合适的质控指标成分。

  此外陈若芸也指出，目前大陆常用的方法（用齐墩果酸或熊果酸为对照品，以比色法做多元化的分析）测得的三萜含量过高，与实际不符，应改以多数灵芝都有的三萜成分（如灵芝酸A或B）作为比色法的标准品进行定量分析，或是采用较严谨的HPLC法测定总三萜酸的含量（定性＋定量）或指纹图谱分析（定性）。也唯有采取正确的检测的新方法，才能有助于灵芝质量的掌握。

  灵芝属种类众多，化学成分也很多元2010年版《中国药典》里收录的灵芝品种有赤芝（Ganoderma lucidum）、紫芝（G.sinense）和树舌（G. applanatum）三种。而实际做过药理或化学研究的灵芝属真菌，目前为止则有赤芝（G. lucidum）、松杉灵芝（G. tsugae）、树舌灵芝（G. applanatum）、薄树芝（G. capense）、日本灵芝（G. japonium）、紫芝（G. sinense）、台湾灵芝（G. fomosanum）、黑灵芝（G. atrum）、长孢灵芝（G. boniense）、无柄灵芝（G.resinaceum）、茶病灵芝（G. theaecolum）、鹿角灵芝（G. amboinense）、南方灵芝（G. australe）、硬孔灵芝（G. duropora）……等二十多种，研究的部位包含了灵芝子实体、菌丝体、孢子粉和发酵液，发现的化学成分也非常多元，包括：

  其中三萜类化合物是灵芝中很重要且有着非常明显生物活性的成分，目前从灵芝属得到的三萜化合物大多是四环三萜（220种），少数是五环三萜（8种）。其中四环三萜属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物（编者注：四环三萜结构大多含有羧基，呈酸性，所以又称三萜酸），按分子中碳原子数可分为C30、C27、C24三大类，根据所含功能团和侧链的不同，又可分为15种基本结构骨架。

  1978年我进到中国医学科学院药物研究所工作的第一件事是分析虫草，第二项工作就是分析灵芝孢子粉。

  早年，我们有个准字号的药，叫肌生注射液，以灵芝孢子粉提取物做成的注射针剂，用来治疗肌强直、肌肉萎缩、红班性狼疮等免疫性疾病。最早它的名字叫731（赤芝孢子粉提炼制成）和741（以薄树芝菌丝体提炼制成），代表1973年1月和1974年1月开始生产制造的。

  所以在灵芝方面，我一开始的工作就是分析薄盖灵芝的菌丝体，后来也做过赤芝孢子粉接着又陆续做了赤芝子实体、紫芝子实体、松杉灵芝子实体，最近则做了硬孔灵芝子实体、茶病灵芝子实体的化学成分研究。

  不过灵芝孢子粉里的三萜类含量极低，吃不出苦味，含量差不多只有十万分之一或百万分之一，根据当时的经验，大约2吨左右的孢子粉，才能得到50公斤左右的脂溶性萃取物，分离得到只有100多毫克，甚至几十毫克的三萜类化合物。

  所以假如没有大量的材料，很难从孢子粉里分离到这些化学成分。因此如果制成品没有经过大量浓缩，用常规的办法去测孢子粉里的三萜类化合物，大多数都检测不出来。孢子油也是同样的情况。

  我们在赤芝子实体里分离到15种三萜，并从紫芝子实体乙醇提取物的“氯仿部分”和“乙酸乙酯部分”分离到23个化合物，包括三萜2个、甾体12个、环肽类化合物1个、生物碱2个、鞘脂类化合物3个、呋喃衍生物1个、脂肪酸2个。

  紫芝的甾体化合物和赤芝比较相似，生物碱则是化学成分中含量较高的，但三萜化合物只有两种，而且含量极低，用常规方法检验测试几乎测不到。以我们当时的研究来说，20公斤的紫芝子实体里只拿到2、3毫克的三萜，这个量就没有进一步做活性试验的可能性。所以从我个人的观点来看，将来药典应该把赤芝和紫芝分开，作为两种药材，因为它们的化学成分差异性很大，尤其紫芝的三萜含量特别低，如果把三萜作为灵芝的质控指标，那紫芝都是不合格的。所以把这两个东西放在一起做质量控制标准，很难达到目的，分成两种药材是比较合适。

  另外我们也从松杉灵芝乙醇提取物得到19个化合物，其中在乙酸乙酯部分共分离到10个三萜类化合物。其他学者从松杉灵芝得到一个三萜苷类化合物，也就是在侧链上连接了一个糖，这是比较罕见成分结构。

  而在福建常被使用的硬孔灵芝，其化学成分我们分到了甾体类8个，甾体酯类2个，神经酰胺类1个，脑苷类1个，脂肪酸1个，芳香类1个。

  2010年版药典只收录了灵芝多糖的测定方法，灵芝中另外一种活性成分“三萜类”仍未有质量控制标准，但目前从灵芝属真菌中分得的三萜类成分已超过220种，其中大部分是从赤芝中分离得到，且有着非常明显的药理活性，因此研究灵芝中三萜类成分的质量操控方法非常必要。

  我们以灵芝酸B为标准品（对照品），建立了用比色法定量测定灵芝总三萜酸含量的方法。这样的解决方法准确性、重现性好、样品背景干扰小，适用于灵芝子实体和灵芝孢子粉中总三萜酸的含量测定。

  很多报导指出灵芝孢子油里灵芝三萜酸含量高达20%，实际上含量并没那么高，是因为他们采用齐墩果酸或熊果酸作为对照品的缘故。灵芝里并没有这两种化合物，而且它们的稳定性很差。我们曾做过用齐墩果酸做对照品，跟着时间的延长，它的吸收值会愈来愈高，所测出来的含量也就愈来愈高，可能十分钟时检测时是15%，三十分钟测时就会变成20%。因此用齐墩果酸或熊果酸来做对照品是不合适，也不科学的。

  以灵芝酸B为对照品的比色法测定灵芝总三萜酸的方法如下：灵芝子实体、孢子粉用无水乙醇回流提取；提取液经过碱化、酸化后，用氯仿萃取；萃取液经无水硫酸钠干燥后减压蒸干，制成无水乙醇溶液；与硫酸加热产生颜色反应，测定其吸光值。

  将8种灵芝样品（包括野生赤芝，以及段木栽培的赤芝、松杉灵芝、紫芝，还有草栽赤芝，以及破壁与未破壁赤芝孢子）以上述比色法测定总三萜酸含量，其中破壁与未破壁赤芝孢子，以及段木栽培紫芝，并未测到总三萜酸，其他样品含量则在千分之1～3之间。这结果不仅再次说明紫芝与赤芝、松杉灵芝在化学成分上的不同，也突显出破壁与未破壁并不影响孢子的三萜含量。

  以上这9种成分是灵芝普遍都含有的三萜酸，其中又以灵芝酸A最多，灵芝酸B次之，然后是灵芝酸C2。我们检测过很多种灵芝，几乎都含有这三种灵芝酸，而且含量相对较高。

  2014年美国药典委员会制定的灵芝品质衡量准则所采用的三萜酸标准品则是10个，其中有3个和我们不一样。为何会有这样的差别，可能是我们的灵芝样品不一样，有些美国药典委员会选择的指标，在我们检测的各种灵芝里含量相对较低。

  以HPLC测定灵芝样品三萜酸含量的方法：以精密称取生药样品粉末（样品均过40目筛），每种2份，每份500mg。各加入三氯甲烷100mL，回流1小时，冷却后过滤。浓缩至干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀、过滤、取滤液作为供试溶液。按上述色谱条件进样分析，每份2次，每次20μL，进行测定。

  我们利用这样的解决方法检测了30个产地的灵芝（涵盖西藏、福州、江苏、山东、广东、北京、贵州、安徽、浙江等不同省份，有野生、有栽培，而栽培的有用草栽、木屑栽或段木栽培），其9种三萜酸的含量，其中一个结果如下：上面（图A）是我们选的九种三萜酸标准品的HPLC图，下面（图B）是木屑栽培的赤芝样品的HPLC图。

  把这30个产地的灵芝测得的九种三萜酸含量加在一起，视为总三萜酸的含量，最高可达千分之九，最低只有千分之一。显示地理环境（产地）与栽培条件对三萜酸含量会有很大的影响，其中后者影响更大。除此之外，在做栽培时，还必须选好品种，因为某些品种的三萜含量相对较低。

  赤芝、紫芝已被定为法定药材，且被广泛人工栽培、产品众多，还有别的品种，如松杉灵芝、硬孔灵芝等，也被普遍的使用。这些灵芝品种之间的化学成分异同并没有考察研究的报导，也缺乏三萜化合物的测定方法的全面研究，因此我们开展了灵芝中三萜酸指纹图谱（特征图谱）的研究。

  这个方法会比前面所提的“用HPLC测定三萜酸含量”要简便一些，而且有很好的准确性和重复性，能够迅速知道灵芝材料里所含的「三萜酸种类」。其检测的新方法和供试品的制备方法，大多数都和前面的HPLC检测三萜酸含量的做法类似。

  我们选取19种三萜化合物的标准品，除了上述提到的9种灵芝酸，还有灵芝酸I、灵芝酸LM1、灵芝酸C、灵芝酸D、灵芝酸E、赤芝孢子酸A、赤芝酮A、赤芝酸C、化合物B9，以及12-乙酰基-3-羟基-7, 11, 15, 23-四羟基-羊毛甾-8-烯-26-（12-Acetoxy-3-hydroxy-7, 11, 15, 23-tetraoxo-lanost-8-en-26-oic acid），建立灵芝的HPLC指纹图谱，图谱上出现的19个峰，就犹如灵芝的指纹特征。再以这个灵芝指纹图谱，和18种来自各产地的灵芝样品（包括赤芝、鹿角灵芝、松杉灵芝、紫芝、硬孔灵芝等品种，有草栽、木屑栽和野生的）进行比对，分析它们和灵芝指纹图谱的相似性。

  其中赤芝（栽培，11个）相似度大于0.92，虽然小有差异，但都有那19个共有峰，显示它们的成分绝大多数都是一样的；野生赤芝（2个）相似度各为0.909、0.773，显示野生的成分差异性较大；鹿角灵芝（2个）相似度在0.942、0.840，也有较大的差异性；松杉灵芝相似度是0.856；紫芝和硬孔灵芝则是在我们的检验测试条件下，检测不出这19个峰。

  从我们这些年来对于灵芝属化学成分和质量操控方法所做的研究工作，可以归纳出几个结论：

  第一，通过比较三种灵芝子实体化学成分不难发现，松杉灵芝和赤芝中的三萜类成分较为接近，但紫芝中却较少含有以上两种灵芝中所含有的三萜类成分，而是以甾体、生物碱和鞘脂类化合物为主，可见紫芝和赤芝或松杉灵芝在化学成分方面有较大的不同。这个观点与分类学上松杉灵芝和赤芝在灵芝属灵芝组，而紫芝分在灵芝属紫芝组相吻合。

  第二，在灵芝分类学上，赤芝和松杉灵芝同为灵芝属灵芝组，而紫芝和硬孔灵芝则属于灵芝属紫芝组，以HPLC测定三萜化合物存在的情况去看，两者也有明显的区别。

  第三，关于灵芝孢子粉的质量控制问题，需要找到更合理的质控指标（不宜用子实体的指标），进而制定孢子粉的质量控制标准。

  第四，很多灵芝产品的三萜含量标示过高与事实不符，还在于测定的对照品多以齐墩果酸、熊果酸为对照品，但灵芝本身不含这些成分，导致含量误差太大，有误导消费者之疑。

  （编者注：比如灵芝孢子油，导致误差的原因是在测定过程中油里大量的油酸，麦角甾醇都会和试剂发生反应，导致结果和真实的含量千差万别）

  第五，从赤芝的指纹图谱和相似度结果看出，它们的共有峰均为19个，相似度虽有差异，但所含成分绝大多数都是一致的。这也说明了我们建立的“灵芝HPLC指纹图谱”是可当作赤芝材料或产品的质控标准。

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