醋酸纤维素薄膜电泳操作关键及常见过失和失利原因剖析
醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化构成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。种薄膜对蛋白质样品吸附性小,简直能彻底消除纸电泳中呈现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较小,它所包容的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由样品传导,所以别离速度快,电泳时间短,样品用量少,5 μg 的蛋白质可得到满足的别离效果。因此特别适合于病理情况下微量反常蛋白的检测。
(1)别离效果好。对蛋白质样品吸附很少,无“拖尾”现象,染色后布景能彻底脱色,各种蛋白质染色带别离明晰,因此提高了定量测定的精确性。
(2)快速省时。因为亲水性较滤纸小,电渗效果小,电泳时大部分电流是由样品传导的,所以别离速度快,电泳时间短,一般电泳45~60分钟即可,加上染色、脱色,整个电泳完结仅需90分钟左右。
(3)灵敏度较高,样品用量少,血清蛋白电泳仅需2 μl 血清,故常用于检测在病理情况下微量反常蛋白质的改动。
(4)运用面广。某些蛋白质在纸上电泳不易别离,如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等用醋酸纤维素薄膜电泳能较好地别离。
(5)易保存,易定量。醋酸纤维素薄膜电泳染色后,经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成通明的干板,有利于扫描定量及长时间保存。
醋酸纤维素膜通过冰醋酸乙醇溶液或其它通明液处理后可使膜通明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长时间保存。
1. 资料与试剂醋酸纤维素膜通常用市售产品,常用的电泳缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液,浓度在0.05~0.09 mol/L。
(1)膜的预处理:有必要于电泳前将膜片浸泡于缓冲液,渗透后,取出膜片并用滤纸吸去剩余的缓冲液,不行吸得过干。并在一角做上记号。
(2)加样:样品用量依样品浓度、自身性质、染色办法及检测的新办法等要素决议。对血清蛋白质的惯例电泳剖析,每cm加样线 μg的蛋白质。
(3)电泳:可在室温下进行。电压为25 V/cm,电流为0.4~0.6 mA/cm宽。
(4)染色:一般蛋白质染色常运用氨基黑和丽春红,糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂,脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。
(5)脱色与通明:对水溶性染料最遍及运用的脱色剂是5%醋酸水溶液。为了长时间保存或进行光吸收扫描测定,可浸入冰醋酸:无水乙醇=30:70(V/V)的通明液中。
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