纸上电泳实验报告 前言纸层析法纸层析法又称纸色谱法，是目前大范围的应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量。纸层析法是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。纸层析法通常用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素最重要的包含胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。图1叶绿素的分离氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本单位，大范围的使用在食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展慢慢的变成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量慢慢的变大，品种变更慢慢的变快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品制造业占61％，在饮料工业占30％，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用：(1)在饮食业的应用(2)在医药工业的应用(3)在饲料添加剂行业的应用(4)在化妆品行业的应用(5)在农业上的应用(6)在别的行业的应用氨基酸工业还有着广阔的发展前途：(1)传统的氨基酸生产方法(2)运用基因工程手段生产氨基酸(3)全力发展药用中间体,具体为：①氨基酸及其衍生物慢慢的变成为药用中间体②非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料③生产高的附加价值的非天然氨基酸一、实验目的(1)掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术。(2)学习未知样品的氨基酸成分分析的方法。二、实验原理(1)纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流过固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。(2)溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示。(3)Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。(4)在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素相关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。材料与方法三、实验装置与试剂(1)氨基酸标准液(1mg/ml)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。(2)80%甲醇(3)%茚三酮丙酮溶液(4)氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)(5)正丁醇实验仪器(1)新华滤纸×1(2)培养皿×1(3)电热鼓风干燥箱×1(4)吹风机×1(5)毛细管×4针、线)滤纸选用国产新华1号滤纸，6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用铅笔在线上标上四个点作为点样位子。点样点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边莫接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。(3)展层将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置。酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。显色待展层基本结束后,置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。Rf值的计算前言血清蛋白：血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70000，这就是一个数据了。在做PCR的时候会用到它。牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD。等电点。含氮量16%，含糖量%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。醋酸纤维薄膜电泳：醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以—为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。应用醋酸纤维薄膜电泳简单易操作、快速、廉价。已经大范围的使用在血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。特点：1.醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。灵敏度较高，样品用量少。血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。2、醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，简单易操作，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。一、实验目的1.掌握电泳法分离血清蛋白质的原理；2.掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作方法。二、实验原理1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不一样的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离2.影响电泳迁移率的因素：内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状外因：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象3.血清中各种蛋白质的等电点在～之间，在的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。4.醋酸纤维素溶于有机溶剂后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。现已大范围的使用在血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面5.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。三、实验材料及试剂1、实验器材1.电泳仪：为电泳提供直流电源。2.电泳槽：为电泳提供场所。3.血清加样器：可用盖玻片或微量加样器。4.醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm5.其它：培养皿、滤纸、镊子等2、实验材料及试剂材料：牛血清1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液()%氨基黑10B染色液3.漂洗液4.透明液：临用前配制甲液：取冰乙酸15ml，无水乙醇85ml，。乙液：取冰乙酸25ml，无水乙醇75ml。5.保存液：液体石蜡6.定量洗脱液四、实验步骤1、电泳槽的准备电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。2、醋酸纤维素薄膜的润湿将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后，用镊子小心夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用滤纸吸干表面液体。3、点样把膜条铺在玻璃板上，将点样器在血清中沾一下，再在膜条一端处轻轻水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。此步是实验的关键。4、电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上，则氨基酸分子带有正电荷，电泳时向负极移动；若溶液的pH高于等电点，氨基酸分子带有负电荷,电泳时向正极移动。电泳过程中，由于电极反应会使连接正极和负极的电解液的pH向相反方向变化，所以应用缓冲溶液以保持pH相对来说比较稳定。另外，选用挥发性的缓冲溶液较好，因为电泳后滤纸烘干时容易除去，以减少对显色的影响。三．实验用品仪器：DY-W2型电泳仪、DC-Ⅱ型电泳槽、镊子、滤纸、直尺、铅笔、毛细管、电吹风机、喷雾器、剪刀。药品：/L甘氨酸、/L赖氨酸、甘氨酸与赖氨酸的混合液、%茚三酮-乙醇溶液、1mol/L乙酸溶液。四．实验步骤1、点样取12cm*8cm滤纸一块，用铅笔在滤纸之一端2cm处划以直线为原点线，在原点线个点，分别注上“甘”、“混””赖”3个字,然后再3个点上点样.2、准备本实验使用DY-W2型电泳仪和与其配套的DC-Ⅱ型电泳槽.(1)向电泳槽内加入1mol/L乙酸溶液,至红水平线ml),可通过底角调平.盖好电泳槽的盖.(2)检查电泳仪的开关是不是在“关”的位置,然后用输出引线把电泳仪和电泳槽的“+”、“_”、极依次连接好.(3)调整“输出选择”,旋至零位,将选择开关扳到“100mA,600V”的位置.(4)打开电源开关,指示灯亮,预热10min.(5)将点好样的滤纸放在电泳槽的电解液中全部浸湿,立即取出放于支架(两槽之间的平台上),纸条的两端要浸在电解液中(点样处绝对不可以浸入电解液),由于甘氨酸和赖氨酸在1mol/L的乙酸溶液中均带正电荷,所以要把点样的一端浸入连接正极的槽内,盖好电泳槽盖.电泳过程中会放出热量,电泳槽中有两个空腔利于散热,对热敏感的物质(如酶蛋白)进行电泳时,若环境和温度过高,能够最终靠自来水对支持物或缓冲溶液进行冷却.3、电泳调整“输出选择”,使电压达到400V,电泳10min.如果电泳一段时间后电压下降,应调整电压到400V.在实验过程中应有人观察电压与电流的大小,并在相隔2-5分钟内记录电流和电压.4、显色用镊子取出滤纸,用电吹风吹干,喷上茚三酮显色剂润湿滤纸,再用热吹风吹干显出色斑.注意防止显色剂流动,冲洗电泳结果.5、记录用铅笔描出色斑的轮廓,量出色斑(中心浓度最高处)至原点线的距离(cm),将滤纸贴在实验报告上,并将环境和温度、电解液、电压、通电时间、显色剂等实验条件同样纪录在报告上。五．注意事项1．点样应在滤纸的一端距纸边２－１０cm处。样品可点成圆形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为５－１０微克和５－１０微升。点样方法有干点法和湿点法。湿点法是在点样前即将滤纸用缓冲溶液浸湿，点样时可用吹风机吹干后多次点样，因而可以用较稀的样品。2．严禁空载，空载易造成电泳仪损坏，只有高级双稳电泳仪才提供空载保护。3．电泳完毕后，应先关闭电源，再拔小插头，以免触电。在仪器接通电源工作期间，严禁接触电泳槽电极、电极插头和电泳物等，严禁输出电极与地短路，以免破坏仪器。仪器不许空载运行，防止震动，使用环境应保持干燥，应无腐蚀性气体存在。六．思考题１、为什么电泳法可以分离氨基酸？２、在重复使用电泳仪时，怎么来控制电泳时的电压和电流？３、同时进行多组样品电泳时，怎么来控制电泳时的电压和电流？４、当一个电泳仪同时带动两个电泳槽时，电流表的电流读数与实际电泳的电流数有何关系？５、电泳电压高低与电泳时间有何关系？６、在本次试验中是采用恒电压电泳或是恒电流电泳？或两者均不是？根据实验纪录的数据分析。

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